Tác giả: Trần Yên Thảo, Rosalind Deaker, Trần Linh Thước, Lê Thị Xuân Mai
1. Mở đầu
Cố định đạm sinh học là nguồn cung cấp nitơ quan trọng cho sản xuất nông nghiệp. Các vi sinh vật cộng sinh với cây họ đậu, gọi chung là Rhizobium cung cấp 200 đến 300 kg N/ha, trong khi đó các vi khuẩn cố định đạm tự do cung cấp 38kg N/ha cho cây ngũ cốc. Cộng sinh giữa cây họ đậu và Rhizobium sản xuất khoảng 80% lượng N cho cây ngũ cốc trong các hệ thống canh tác tại Úc. Tính toán chỉ dựa vào giá trị thay thế phân bón hoá học N thì cố định đạm sinh học đã đóng góp hơn 3 tỷ đô la mỗi năm cho sản xuất nông nghiệp tại Úc.
Tuy nhiên, hiệu quả cố định đạm thì phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó yếu tố góp phần quan trọng là chất lượng của chế phẩm. Số lượng tế bào Rhizobium trong 1g than bùn thay đổi từ <106 đến >109 tế bào/g than bùn theo kết quả khảo sát chất lượng sản phẩm được sản xuất từ ba cơ quan nghiên cứu, trong đó các mẫu đạt tiêu chuẩn (≥108 tế bào/g, TCVN 6166:2002) chỉ chiếm 20% trong tổng số mẫu thử nghiệm. Nghiên cứu này nhằm xác định ảnh hưởng của than bùn đến chất lượng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm công sinh Rhizobium và vi khuẩn cố định đạm tự do Azospirillum.
 2. Vật liệu và phương pháp
- Than bùn: than bùn được thu thập tại 12 tỉnh trong nước, tại các mỏ than bùn đang được khai thác phục vụ sản xuất phân bón hữu cơ, phân bón hữu cơ vi sinh, bao gồm 19 mẫu than bùn. Mẫu than bùn Úc là than bùn đang được sử dụng trong sản xuất thương mại chế phẩm vi khuẩn cố định đạm tại Úc (công ty Becker Underwood).
- Giống vi sinh vật: bao gồm 2 chủng Rhizobium (VD-RS 1 và VD-RG 1) và 3 chủng Azospirillum (VD-AS 1, VD-AS 2, VD-AS 3). Chủng VD-RS 1 là chủng vi khuẩn cố định đạm công sinh chuyên biệt cho cây đậu tương và chủng VD-RG 1 cho cây lạc. Các chủng này thuộc bộ giống vi sinh vật của Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu.
- Nhân sinh khối vi khuẩn: các chủng VD-RS 1 và VD-RG 1 được nhân sinh khối trong môi trường YMB (Manitol: 10 g/l; yeast extract 1g/l, MgSO4.7H2O 0,2g/l; NaCl 0,1g/l; K2HPO4 0,5g/l); các chủng VD-AS 1, VD-AS 2 và VD-AS 3 trong môi trường DF (Dworkin Foster) ở thí nghiệm so sánh ảnh hưởng của 15 loại than bùn đến số lượng vi khuẩn và môi trường NFB (acid malic 5,0 g/l; K2HPO4 0,5 g/l; MgSO4.7H2O 0,2g/l; NaCl 0,1g/l; CaCl2 0,02 g/l; FeEDTA 4,0 ml/l, dung dịch vi lượng 2,0 ml/l; dung dịch hỗn hợp Vitamin 1ml/l hoặc yeast extract 0,5g/l ) ở thí nghiệm so sánh 3 loại than bùn. Thời gian nhân sinh khối là 3 ngày đối với Azospirillum và 5 ngày đối với Rhizobium.
- Sản xuất chế phẩm: dịch sinh khối được trộn với than bùn đã được khử trùng bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma (liều lượng chiếu là 40 kGy, tại Trung tâm nghiên cứu và triển khai công nghệ bức xạ - VINAGAMM). Lượng dịch sinh khối cho vào than bùn phụ thuộc vào khả năng giữ nước của mỗi loại than bùn và được xác định theo H. Somasegaran và H.J Hoben. Sản phẩm ổn định về số lượng tế bào sau thời gian từ 1 đến 4 tuần.
- Xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong than bùn: xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn và đếm số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường dinh dưỡng YMB có bổ sung Congo red và agar-agar (5 ngày) đối với các chủng Rhizobium và NFb bổ sung agar-agar đối với Azospirillum (3 ngày).
- Xác định số lượng tế bào vi khuẩn trên hạt: khử trùng bề mặt hạt sau đó nhiễm chế phẩm lên hạt. Khử trùng hạt đậu tương và hạt lạc bằng hydrogen peroxide (3%), sử dụng acid sulfuric đậm đặc cho hạt lúa. Xác định số lượng vi khuẩn tồn tại trên hạt theo thời gian sau 30 phút, 2 giờ và 24 giờ. Chi tiết phương pháp theo  H. Somasegaran và H.J Hoben.
- Phân tích các đặc tính lý hoá học của than bùn: chất hữu cơ (TCVN 9294-2012); Acid humic (TCVN 8561-2010); N tổng số (TCVN 8557:2010); N hữu hiệu ( TCVN 361-2006); P2O5 hữu hiệu (TCVN 8559-2010); K2O hữu hiệu (TCVN 8560-2010); pHH2O (TCVN 5979-2007); khả năng giữ nước (H. Somasegaran và H.J Hoben).
3. Kết quả
3.1. Một số đặc điểm lý hóa học của than bùn Việt Nam
Kết quả cho thấy các mẫu than bùn rất khác nhau về đặc điểm hóa học. pH có sự khác biệt lớn, thấp nhất là 1,67 (mẫu than bùn P13) và cao nhất là 6,53 (P9). Các mẫu than bùn ở tỉnh Kiên Giang ngoại trừ mẫu ở huyện Kiên Lương có pH cao, các mẫu khác có pH rất thấp trong khi các mẫu ở Đắc Nông có pH cao (pH trên 6). Các mẫu than bùn ở Miền bắc có pH thấp, dao động từ 3,61 đến 4,82. Tương tự, có sự khác biệt lớn giữa các mẫu than bùn về hàm lượng hữu cơ và acid humic. Hàm lượng chất hữu cơ biến động từ 12,4% đến 51,7%, so với 65,6% ở mẫu than bùn của Úc. Chỉ có 6/19 mẫu than bùn có hàm lượng chất hữu cơ >40% (40,1-51,7%). Nhìn chung các mẫu than bùn ở Miền Bắc có hàm lượng chất hữu cơ thấp hơn so với các mẫu ở Miền Nam. Hàm lượng acid humic cao nhất ở mẫu than bùn Úc (27,6%) và mẫu than bùn có hàm lượng acid humic cao nhất trong số các mẫu than bùn Việt Nam phân tích đạt 17,2% (mẫu tại mỏ ở huyện Đắc Min, tỉnh Đắc Nông). Có sự tương quan khá chặt giữa hàm lượng chất hữu cơ và acid humic, hệ số tương quan r=0,76. Hàm lượng chất hữu cơ và acid humic có tương quan chặt với N tổng số (r trung bình là 0,71) trong khi đó không có sự tương quan với N, P, K hữu hiệu. Điều này có thể có căn cứ thêm về độ phân giải cao hơn của các mẫu có hàm lượng acid humic cao so với các mẫu khác có hàm lượng thấp hơn. Acid humic cao và hàm lượng chất hữu cơ cao của than bùn có thể một phần dẫn đến kết quả của khả năng giữ nước cao (hệ số tương quan acid humic và khả năng giữ nước là 0.69 và của hàm lượng chất hữu cơ là 0,58).
3.2. Tăng trưởng và tồn tại của các chủng Rhizobium trong các loại than bùn khác nhau
Số lượng tế bào vi khuẩn khác biệt lớn, phụ thuộc vào các loại than bùn khác nhau. Đối với vi khuẩn cộng sinh Rhizobium, số lượng tế bào ở các mẫu than bùn có số lượng cao nhất cao hơn các mẫu có số lượng thấp nhất hơn 100 lần (hơn 2 log,  từ 7,29 đến 9,76). Đa số các mẫu than bùn có số lượng tế bào Rhizobium ở giá trị log nhỏ hơn 9 (số lượng tế bào/g than bùn <109). Số lượng tế bào Rhizobium đạt cao nhất (>109 tế bào/g) ở mẫu than bùn Úc và 2 mẫu than bùn Việt Nam (than bùn Đắc Min, tỉnh Đắc Nông và than bùn Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai). Đối với vi khuẩn cố định đạm tự do Azospirillum, số lượng tế bào/g than bùn cũng thay đổi lớn giữa các loại than bùn thí nghiệm. Số lượng tế bào đạt cao nhất và thấp nhất khác nhau hơn 1000 lần (3 log, từ  4,32 đến 7,89).  Đa số các mẫu than bùn có số lượng Azospirillum thấp hơn so với mẫu than bùn Úc, thấp hơn từ 10 đến 100 lần. Chỉ có 3 loại than bùn Việt nam (than bùn ở mỏ Đắc Min - P6, P7 và ở mỏ Trảng Bom P12) trong tổng số 15 loại khảo sát có số lượng tế bào tồn tại trong than bùn tương đương với than bùn của Úc.
Có sự tương quan tuyến tính chặt giữa số lượng tế bào Rhizobium và Azospirillum với hàm lượng chất hữu cơ, acid humic và khả năng giữ nước của than bùn trong khi đó hầu như không có sự tương quan giữa số lượng tế bào vi khuẩn với hàm lượng N, P, K hữu hiệu của than bùn. Hệ số tương quan r của quan hệ gữa khả năng giữ nước và Rhizobium, Azospirillum là 0,83 và 0,82 theo thứ tự. Các mối tương quan này nói lên sự phụ thuộc về khả năng tồn tại trong than bùn của các chủng vi khuẩn vào một số đặc tính của than bùn hay nói khác đi, chất lượng của chế phẩm vi khuẩn cố định đạm phụ thuộc vào một số tính chất của than bùn (khả năng giữ nước, hàm lượng chất hữu cơ và acid humic).
Có sự tương quan tuyến tính chặt giữa số lượng tế bào Rhizobium và Azospirillum với hàm lượng chất hữu cơ, acid humic và khả năng giữ nước của than bùn trong khi đó hầu như không có sự tương quan giữa số lượng tế bào vi khuẩn với hàm lượng N, P, K hữu hiệu của than bùn. Hệ số tương quan r của quan hệ gữa khả năng giữ nước và Rhizobium, Azospirillum là 0,83 và 0,82 theo thứ thự (đồ thị 3.1). Các mối tương quan này nói lên sự phụ thuộc về khả năng tồn tại trong than bùn của các vi khuẩn vào một số đặc tính của than bùn hay nói khác đi, chất lượng của chế phẩm vi khuẩn cố định đạm phụ thuộc vào một số tính chất của than bùn (khả năng giữ nước, hàm lượng chất hữu cơ và acid humic).
Số lượng tế bào tăng đáng kể sau 1 tuần tạo chế phẩm và tăng nhẹ sau 2 tuần và 4 tuần ở 2 loại than bùn P6 và P12 trong khi đó số lượng tế bào trong than bùn P17 hầu như không thay đổi sau 1, 2 và 4 tuần. Sự tích luỹ tế bào của cả hai chủng Rhizobium trong 3 loại than bùn thì khác nhau. Số lượng tế bào trong than bùn P6 và P12 cao hơn nhiều so với P17, đạt số tế bào >109 cfu/g trong khi chỉ đạt ở mức độ 107 cfu/g đối với than bùn P17.
Đối với Azospirillum kết quả cho thấy số lượng tế bào trong than bùn tăng theo thời gian, tăng đáng kể ở thời điểm 1 tuần so với 2 tuần và 4 tuần. Sự tích lũy tế bào trong  than bùn P6 và P12 cao hơn có ý nghĩa thống kê so với trong than bùn P17 (109 tế bào/g so với 107 tế bào/g) đối với cả 3 chủng thí nghiệm. Hai chủng VD-AS 1 và VD-AS 3 sinh trưởng và tồn tại tốt hơn trong than bùn so với chủng VD-AS 2 ở tất cả các thời gian theo dõi.
3.3. Tồn tại của các chủng vi khuẩn Rhizobium và Azospirillum trên hạt
Hiệu quả chế phẩm đối với cây trồng thì phụ thuộc vào số lượng tế bào của các chủng vi sinh vật có trong chế phẩm bên cạnh đó còn phụ thuộc vào số lượng của chúng trên hạt sau khi nhiễm chế phẩm lên hạt. Số lượng tế bào tồn tại trên hạt là một trong các yếu tố quan trọng xác định sự thành công của một chế phẩm.
Sự tồn tại của Rhizobium: cho thấy phầm trăm số lượng tế bào có trên hạt tại các thời điểm khác nhau sau khi nhiễm (30 phút, 2 giờ và 24 giờ) và trong 3 loại than bùn khác nhau. Số lượng tế bào  giảm mạnh ngay sau khi nhiễm chế phẩm lên hạt 30 phút. Số lượng tế bào tiếp tục giảm sau đó, sau 2 giờ và  24 giờ. Phản ứng của các chủng Rhizobium đối với các loại than bùn khác nhau thì khác nhau. Hai loại than bùn P6 và P12 làm tăng sự tồn tại của tế bào trên hạt so với than bùn P17.  Sau 24 giờ nhiễm lên hạt số lượng tế bào chết đi là 97,5% trong than bùn P17 so với chỉ 64,6% trong than bùn P6. Tuy nhiên, số lượng tế bào tồn tại trên hạt ở than bùn P12 thấp hơn so với trên than bùn P6, số tế bào chết đi là 83,8%.
Đối với Azospirillum số lượng tế bào cũng giảm ngay sau khi nhiễm lên hạt mặc dù số lượng tế bào có trên hạt khác nhau phụ thuộc vào thời gian và các loại than bùn khác nhau (biểu đồ 3.4).  Tế bào tồn tại kém nhất trên hạt ở than bùn P17, chỉ còn lại 3,3% đối với chủng VD-AS 1 và 1,5% đối với VD-AS 3 sau 24 giờ nhiễm trong khi đó ở than bùn P6 và P12 số lượng tế bào tồn tại trên hạt lớn hơn 20%. Sự sống của tế bào trên hạt cũng phụ thuộc vào chủng Azospirillum. Chủng VD-AS 3 tồn tại tốt hơn so với chủng VD-AS 1. Số tế bào còn lại trên hạt sau 30 phút nhiễm chế phẩm từ than bùn P6 là 74,5% đối với chủng VD-AS 3 và 58,5% đối với chủng VD-AS 1.

4. Thảo luận
Mục tiêu của sản xuất chế phẩm vi sinh là để tạo chế phẩm có số lượng tế bào cao sao cho sau khi nhiễm lên hạt số lượng tế bào sống ở vùng rễ đủ để bảo đảm tạo quần thể tế bào, hình thành nốt sần và cố định đạm xảy ra nhanh chóng và hiệu quả, do đó thu được hiệu quả cao nhất về năng suất cho cây trồng. Nghiên cứu của Roughley và cộng sự cho thấy khi tăng số lượng tế bào Rhizobium trên hạt đậu lupin từ 1,9 x 104 lên 1,9 x 106 tế bào/hạt, số lượng nốt sần tăng từ 8 lên 26 nốt sần/cây, trọng lượng nốt sần tăng từ 65 mg/cây lên 393 mg/cây, số cây tạo nốt sần tăng từ 89 lên 98%, sinh khối tăng 7,8 tấn/ha lên 9 tấn/ha. Quan trọng hơn, năng suất tăng, từ 1,9 tấn/ha lên 2,1 tấn/ha (10%). Đối với cây đậu tương, nghiên cứu của Brockwell  cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt giữa số lượng Rhizobium và cố định đạm sinh học, năng suất của cây. Năng suất đạt cao nhất khi quần thể Rhizobium xung  quanh rễ đạt >105 tế bào/cây. Công trình của Hume và Blair cho thấy năng suất đậu tương tăng 24% khi số lượng tế bào Rhizobium  trên 1 hạt là 106 so với 105. Nghiên cứu của Hiltbold và cộng sự ngược lại trên đối tượng các chế phẩm thương mại tại Alabama, Hoa Kỳ. Chế phẩm có số lượng tế bào thay đổi từ 103 – 109 tế bào/g. Kết quả cho thấy khi số lượng tế bào/hạt đậu tương <103 thì không có sự hình thành nốt sần nhưng số lượng nốt sần nhiều khi nhiễm chế phẩm lên hạt ở liều lượng đạt 105 – 106 tế bào/hạt. Năng suất khi nhiễm Rhizobium <103 tế bào thì năng suất bằng với đối chứng không áp dụng chế phẩm trong khi đó năng suất tăng khi tăng số lượng tế bào/hạt. Các nghiên cứu về mối tương quan này của đối với các vi sinh vật cố định đạm tự do không nhiều. Đối với cây cao lương, khi áp dụng Azospirillum lên hạt, số lượng cần là 103 – 105 tế bào/hạt, chế phẩm trên nền chất mang than bùn đạt 107 – 109 tế bào/g. Chưa có nghiên cứu ở trong nước về tương quan giữa số lượng tế bào trong chế phẩm và trên hạt với hiệu quả cố định đạm và sinh trưởng, năng suất của cây nhưng hiệu quả của các chế phẩm vi sinh vật đã được chứng minh. Nghiên cứu hiệu quả của Rhizobium đối với cây đậu tương và cây lạc từ năm 2007 đến 2010 trên các vùng sinh thái khác nhau trong cả nước (10 tỉnh) cho thấy có sự trả lời đối với nhiễm chế phẩm nghĩa là cố định đạm tăng (số nốt sần và trọng lượng nốt sần), năng suất sinh khối và năng suất hạt tăng trong hầu hết các thí nghiệm. Hiệu quả cũng được khẳng định trong các điểm trình diễn (181 điểm), năng suất tăng trung bình là 310 kg/ha. Trong tất cả các thí nghiệm này các chế phẩm sử dụng có số lượng tế bào từ 5x108 đến 109 tế bào/g than bùn, liều lượng sử dụng 1-2 kg/ha. Điều này ngụ ý rằng, muốn thu được lợi nhuận từ chế phẩm thì chế phẩm phải chứa đựng một số lượng tế bào tối thiểu để sao cho có một lượng tế bào trên hạt đủ để thực hiện chức năng của vi khuẩn trong chế phẩm đó sau khi chế phẩm được nhiễm lên hạt.
Chế phẩm vi khuẩn thương mại Rhizobium được sản xuất chủ yếu trên nền chất mang than bùn do vi khuẩn Rhizobium tồn tại tốt trong than bùn nhưng số lượng tế bào giảm đi nhanh chóng sau khi nhiễm lên hạt. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tồn tại của Rhizobium trong than bùn bao gồm tính chất của than bùn, nhiệt độ bảo quản, và khả năng giữ nước. Vách tế bào Rhizobium leguminosarum bv. trifolii TA1 dày hơn khi được bảo quản trong chất mang than bùn. Nghiên cứu trên Acinetobacter và Mycobacterium cho thấy có thể sự dày lên của vách tế bào có liên quan đến tăng khả năng tồn tại của tế bào khi phải đối mặt với các stress khác nhau. Sự thay đổi hình thái của tế bào khi sống trong  than bùn của một số chủng Rhizobium  được nghiên cứu bởi Lu và cộng sự. Các thay đổi này có mối quan hệ đến sự tồn tại của tế bào trong than bùn và trên các hạt nhựa (được sử dụng như là mô hình để thay thế hạt của cây trồng trong nghiên cứu).
Nghiên cứu này cho thấy sự tồn tại của các chủng Rhizobium và Azospirillum trong chất mang than bùn phụ thuộc vào các loại than bùn khác nhau. Than bùn P6 và P12 giúp các chủng Rhizobium và Azospirillum tồn tại tốt hơn. Điều này đồng nghĩa với chất lượng chế phẩm tốt hơn. Sự tồn tại của Rhizobium và Azospirillum cũng khác nhau giữa 2 nhóm và giữa các chủng trong cùng một nhóm. Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy yếu tố tồn tại của các chủng vi sinh vật trên hạt là quan trọng và sự ảnh hưởng là khác biệt đối với các loại than bùn khác nhau. Các chủng Rhizobium tồn tai không khác biệt trong than bùn, tuy nhiên sự tồn tại trên hạt của chúng thì khác nhau. Như vậy, chọn lọc chất mang than bùn thích hợp để đảm bảo đạt chất lượng sản phẩm phục vụ cho sản xuất chế phẩm vi khuẩn (đảm bảo số lượng tế bào cần thiết trong chế phẩm và trên hạt sau khi nhiễm) là cần thiết.  Một số tính chất hóa học của than bùn có thể sử dụng để dự đoán chất lượng than bùn trong mối tương quan với chất lượng của chế phẩm, đó là khả năng giữ nước, hàm lượng chất hữu cơ và acid humic.
 5. Kết luận
Sự tồn tại của vi khuẩn cố định đạm Rhizobium và Azospirillum trong than bùn và trên hạt sau khi nhiễm chế phẩm lên hạt thì khác nhau và phụ thuộc vào các loại than bùn khác nhau. Lựa chọn than bùn phù hợp cho sản xuất chế phẩm do đó rất quan trọng để đảm bảo chất lượng của chế phẩm, phát huy được hiệu quả của chúng đối với cây trồng.